實驗報告(硫酸銨法-實驗報告例)

時間：2020-12-08 12:50:10　來源：勤學考試網本文已影響人

姓名：李果學號：201030380109 院系：動物科學學院10級動物生物技術

《生物技術制藥概論》綜合性實驗

“動植物超氧化物歧化酶SOD的制備”

背景介紹：超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）可能與機體衰老、腫瘤發生、自身免疫疾病和輻射防護有關，是一種重要的蛋白質類藥物，可用于炎癥、類風濕關節炎、慢性多發性關節炎及放射治療后的炎癥等。SOD存在于動、植物、微生物中，有Cu-Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD等多種形式存在。植物SOD的研究今年來引起了科學家的特別重視，因為SOD具有清除體內過量的超氧自由基（O2-）的功能，對于預防衰老、血管硬化等有顯著效果，對疾病的治療也初步顯出療效；植物來源的SOD穩定性較動物來源的好，特別是類-SOD，因相對分子量較小，易透性好，引起保健品、美容品方面的特別重視。比較好用的品種有刺梨、茶葉等植物的SOD。此外，植物SOD酶在農業新品種培育研究中也有重要意義。

該綜合性實驗涉及本科程動物細胞制藥、植物細胞制藥及酶工程制藥。實驗過程綜合了藥物制備的重要步驟，如：收集、植物干粉制備、丙酮抽提、清洗、溶血、去血紅蛋白、沉淀、熱處理、分離、透析濃縮、蛋白質類藥物的純化技術、酶類藥物的活性測定等。

實驗目的

通過本實驗學習，使學生掌握生物技術制藥的重要章節：動物細胞制藥、植物細胞制藥、酶工程制藥，提高學生運用知識、對理論知識的應用等綜合能力。

實驗原理

將動植物材料用不同的方法進行細胞破裂后用緩沖液浮洗，再用乙醇、氯仿去除雜質沉淀，在硫酸銨、丙酮作用下使SOD沉淀；最后進行溶解，并用透析、柱層析（DEAE-Sephadex A50;Sephadex G-100;DEAE-cellulose）的方法進一步純化，得到SOD純品。

實驗步驟

3.1 實驗材料：

新鮮桑葉、硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉

3.2 實驗步驟：

[制干粉][提取] 新鮮桑葉丙酮桑葉丙酮干粉磷酸鉀緩沖液

[制干粉]

[提取]

新鮮桑葉

丙酮

桑葉丙酮干粉

磷酸鉀緩沖液

上清液

丙酮

[沉淀酶]

沉淀

pH7.8 磷酸鉀緩沖液

[透析，濃縮]

超濾濃縮

濃縮酶液

Sephadex G-100

[柱層析]

活性組分

DEAE-Cellulose

[離子交換]

梯度洗脫

SOD純品

桑葉SOD制備的技術路線

（1）桑葉→大量清水洗滌干凈→蒸餾水洗滌→濾紙吸干稱50g→研磨機研磨→過濾→上清液→測定體積（V1）

（2）上清液→60℃水浴20min（去雜蛋白）→10000r/min冷凍離心20min →上清液→測定體積（V2

B、純化（硫酸銨分級沉淀法）

按A的體積查出0℃

50%飽和度 4℃

↓ 10000r/min 20min

上清液

↓

90%飽和度 4℃

↓乙醇氯仿去離子水冷水洗滌 10000r/min 20min

乙醇氯仿

去離子水

冷水洗滌

沉淀 5mmol/L PH7.8PBS

C、按表中試劑用量加入試管并在25?C保溫25min。

solution

blank

control

sample

PH8.3PBS

4.7ml

4.5ml

HCl

10μl

SOD sample

0.2ml

鄰苯三酚50mmol/L

10μL

V總

4.7ml

注：緩沖溶劑的配置根據附表的相關濃度進行

D、活力測定：

將樣品溶液傾入1 cm 的比色杯中,在325 nm 處每隔30 s 測定吸光度1 次,選擇時間范圍,控制對照管每分鐘吸光度的變化速率在0.070 左右,記錄樣品溶液每分鐘` 。

E、酶活力的計算:

SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - △A325 ) ×100 % ×V總÷0.070 ×50 %·V定義·V樣。

其中: V總代表反應總體積,

V樣代表加入樣品液的體積,

V定義代表活力單位定義體積(1 ml) 。

實驗數據和實驗結果

1、稱取桑葉重量：50.1246g

2、粗提過程：

（1）實際加入緩沖液體積：70ml V1：40.80ml V2：未測出

（2）分別稀釋倍數： 0.711倍未測出

（3）測定前再稀釋倍數：未知

3、酶活力測定獲得兩組數據：

x1 x2 x3 x4 （未測出）即可根據測出值計算△A325

將以上數據帶入公式：SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - △A325 ) ×100 % ×V總÷0.070 ×50 %·V定義·V樣，即可得到桑葉中SOD的酶活力。

實驗結論及心得

實驗結論

本次實驗由于實驗儀器的故障問題（離心機破損）導致實驗最終無法順利完成，只能完成實驗的前半部分，因此無法測定出桑葉中超氧化物歧化酶SOD的活力；

基本獲得的數據：

包括：桑葉稱重：50.1246g；V1：40.80ml

實驗雖然沒有得出最終的結果，但是通過此次實驗的進行，我們了解到了超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）可能與機體衰老、腫瘤發生、自身免疫疾病和輻射防護有關，是一種重要的蛋白質類藥物，可用于炎癥、類風濕關節炎、慢性多發性關節炎及放射治療后的炎癥等的重要作用，以后有機會會對其進行更加深入的了解與探討；

（二）實驗心得

1、此次實驗的進行，運用到了許多相關學科的知識，如需要了解桑葉與豬血的生理性質、化學緩沖試劑的配置等基礎學科知識。實驗進行過程中，對實驗流程不夠熟悉，充分說明我們對自主創新性實驗基本技能的欠缺以及缺乏自主創新意識，在以后的學習過程中，還得注重對基本實驗技能的培養以及自我實驗素質、創新性意識的提高。

2、另一方面，還得加強自主學習能力，提高自主學習意識，通過自學去提前掌握實驗原理、將實驗操作步驟熟記于心，這樣實驗才能順利進行，才能較高質量的完成創新實驗。

3、提前做好實驗準備是實驗良好進行的基礎，但實驗過程中做好記錄以及實驗后的認真反思以及對實驗前存在問題的探究是實驗后期獲得實驗成果的重要保證。

4、總之，通過此次實驗，我對創新性試驗有了一個較為全面的認識，對以后的學習以及自主實驗的進行有了一個深入的了解，在以后的自主實驗的進行中，我想我能夠準備得更充分，有信心讓實驗順利及有效的進行。

5、實驗后及時與指導老師溝通，探討實驗中存在的問題，更好的解決實驗殘留問題，以期獲得良好的收益。

（三）實驗過程中的難點

（1）活力測定：

將樣品溶液傾入 1 cm 的比色杯中，在 325 nm 處每隔 30 s 測定吸光度 1 次，選擇時間范圍，控制對照管每分鐘吸光度的變化速率在0.070 左右，記錄樣品溶液每分鐘吸光值讀數。

（2）酶活力的計算:

SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - A325 ) ×100 % ×V △ 總÷0.070 ×50 %·V 定義·V 樣。其中: V 總代表反應總體積，V 樣代表加入樣品液的體積，V 定義代表活力單位定義體積(1 ml) 。

附表：硫酸銨共沉淀法濃度差查閱表