肝糖原測定實驗報告x
時間：2020-11-23 00:19:02 來源：勤學考試網 本文已影響 人 
肝糖原的提取、鑒定與定量
一、 實驗目的
掌握組織樣品的制備方法，了解其注意事項。
了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鑒定與蒽酮比色測定糖原含量的原理和注意事項， 掌握其操作方法。
正確操作使用刻度吸管和可調微量取液器。
熟練運用溶液混勻的各種方法(視具體情況，采用合適的混勻方法) 。
正確掌握溶液轉移的操作。
正確操作使用分光光度計。
二、 實驗原理
肝糖原的提取、鑒定
糖原儲存于細胞內，采用研磨勻漿等方法可使細胞破碎，低濃度的三氯醋酸能使蛋 白質變性，破壞肝組織中的酶且沉淀蛋白質，而糖原仍穩定地保存于上清液中，從而使 用糖原與蛋白質等其它成分分離開來。糖原不溶于乙醇而溶于熱水，故先用95%乙醇將 濾液中糖原沉淀，再溶于熱水中。
糖原水溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色。這是糖原中葡萄糖長鏈形成的螺旋中，依 靠分子間引力吸附碘分子后呈現的顏色。糖原還可被酸水解為葡萄糖，利用呈色反應和 葡萄糖的還原性，可判定肝組織中糖原的存在。
CuSO4 十 2NaOH — Na SO4+Cu(OH)2 J
2Cu(OH)2 十 C6H12O6 — 2CuOH十氧化型葡萄糖 +H2O
2CuOH — CuOj 紅色)+H2O
Cu(OH)2 — CuOiM色 )+H2O
肝糖原的定量
糖原在濃酸中可水解成為葡萄糖，濃硫酸能使葡萄糖進一步脫水生成糠醛衍生物
—5-羥甲基呋喃甲醛，此化合物再與蒽酮脫水縮合生成藍色的化合物。該物質在 620nm
處有最大吸收。糖含量在10-100^g范圍內，溶液顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。
利用此反應與同樣處理的已知葡萄糖含量標準溶液比色， 通過標準對照法（直接比較法）
即可計算出樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶液中非常穩定，故在顯色之前，肝組織先 置于濃堿中加熱，以破壞其它成分，而保留肝糖原。
三、材料與方法：以流程圖示意
實驗材料：
（一） 儀器
普通離心機，室溫“00C恒溫水浴箱（*）,分光光度計，精度為10mg級電子
天平（X1）
剪刀（X1）,鑷子（XI），研缽（X1）
試管架（X），（100X15） mm 試管（X3）
刻度吸量管（2mLX1，5 mLX2），1000 ^L微量可調取液器（X）
100mL 容量瓶（X）
白瓷反應板（X）
（二） 實驗樣品和試劑
雞肝。
95%乙醇。
0.31mol/L（5%）三氯醋酸溶液。
0.15mol/L NaCl 溶液。
12mol/L HCl。
12.5mol/L(50 % )NaOH。
碘試劑。
班氏試劑。
5.35mol/L(30%)KOH 溶液。
標準葡萄糖液(50mg/L)。
17mol/L(90 % )H2SO4(用于制備蒽酮顯色劑)。
蒽酮顯色劑：稱取蒽酮0.20g,用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此試劑不穩 定，以當日配制為宜，冰箱保存可用 4-5d。
實驗方法：
吸取1mL量溶液時使用可調微量取液器，吸取1mL以上量溶液時使用刻度吸量管。
(一)肝糖原的提取與鑒定
操作流程如下：
雞肝約1.0g，剪碎
I + 5%CCl3COOH 1 ml
研磨至乳狀
| + 5%CCl3COOH 3 ml
研磨成肝勻漿
全部轉入離心管中，離心 3分鐘(4000 r / min)
I
沉淀(棄去) 上清(取2 ml)
| + 2ml 95%乙醇，混勻，靜置10分鐘
離心5分鐘(4000 r / min)
\
上清(棄去) 沉淀
| +蒸鎦水1 ml
沸水浴2分鐘，溶解沉淀糖原溶液1ml白瓷板孔穴中+濃HCI 5滴加碘試劑2滴
沸水浴2分鐘，溶解沉淀
糖原溶液1ml
白瓷板孔穴中
+濃HCI 5滴
加碘試劑2滴
沸水浴15分鐘，冷卻
加碘試劑2滴
糖原水解液2滴
+ 50%NaOH 5 滴
糖原水解液
+班氏試劑4滴
混勻
沸水浴2分鐘，觀察變化
注意事項
肝糖原提取一步，向上清液中加入 95%乙醇后，務必注意混勻。由于上清液為 水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成兩層?？偭肯鄬^多，混勻操作比較困難，最好 用傾倒混勻，也可用滴管或吸量管吸、吹混勻，或用玻璃棒攪拌混勻。
糖原中葡萄糖螺旋鏈吸附碘產生的顏色與葡萄糖殘基數的多少有關。葡萄糖殘 基在20個以下的會使碘呈現紅色，20, 30個之間使碘呈現紫色，60個以上的會使碘呈 現藍色。淀粉中分枝鏈較長，故呈藍色，而肝糖原分枝中的葡萄糖殘基在 20個以下（通 常8-12個葡萄糖殘基），吸附碘后呈現紅棕色。
糖原水解液中葡萄糖的鑒定一步，加班氏試劑不能過量，否則反應液呈黑色渾
濁，觀察不到應有的結果。
（二）肝糖原定量測定
操作流程如下:
雞肝0.10 g
| + 30%KOH 1.5ml （用吸量管）
沸水浴15分鐘
I
冷卻，全部轉入100 ml容量瓶中
I
加水至標線，仔細混勻，此為糖原提取液
糖原的測定
取3支試管，按下表操作。
試劑（ml）
空白管
標準管
樣品管
蒸餾水
1.0
——
——
標準匍萄糖溶液
——
1.0
——
糖原提取液
——
——
1.0
0.2%蒽酮溶液
（用吸量管）
2.5
2.5
2.5
混勻，沸水浴10分鐘，冷卻。在分光光度計620 nm波長處，用空白管溶液調零，測定 各管溶液的吸光度（A ）。
計算：
TOC \o "1-5" \h \z A 樣品 100 100
肝糖原（g/100 g 肝組織）= x）.05 x x1.11
A標準 肝組織重（g） 1000
四、結果與討論：①結果：實驗數據、現象、圖譜；②討論：以結果為基礎的邏輯 推論，并得出結論。
（一）結果
鑒定實驗中的呈色對比
1）結果:
2）結論：如圖所示，加入提取的糖原溶液后，顏色變淺（碘液稀釋后變淺），但并未變 成紅棕色，所以用這種鑒定方法鑒定不出有糖原的存在。
鑒定實驗中葡萄糖還原反應
1） 結果：
2） 結論：水浴后，溶液的顏色加深，但并未生成紅黃色沉淀，所以用這種鑒定方法鑒
定不出有糖原的存在。
肝糖原定量測定實驗
1）結果
定量實驗中沸水浴后空白管、標準管和樣品管的顏色（從左至右）
吸光度測定結果
吸光度（A）
空白管
標準管
樣品管
第一次
第二次
第三次
平均
2）結論：
A樣品
100
100
肝糖原（g/100 g肝組織）=
-?.05
-X X.11
A標準
肝組織重（g）
1000
根據上式計算，代入A樣品:
=，A標準=
:，肝組織重（g）=，
可得
0.150 100 100
肝糖原（g/100 g 肝組織）= >0.05 X- X 1.11 ?
0.624 0.10 1000
此雞為不飽食雞
